ALTA SENSIBILIDAD DE RT-PCR ANIDADA PARA LA DETECCIÓN DEL VIRUS DEL SÍNDROME DEL TAURA EN CAMARONES PENEIDOS

Abstract

RESUMEN: El desarrollo y la sustentabilidad del cultivo de camarones en América han presentado epidemias virales que afectan significativamente su producción. Para solventar estos problemas, se ha propuesto la detección de infecciones usando protocolos de diagnóstico altamente sensibles, tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Mediante la presente investigación se diseñó un protocolo de PCR por transcripción reversa (RT-PCR) de doble ronda para la detección del virus del síndrome del Taura (TSV). La evaluación de este protocolo se realizó mediante el análisis de 400 muestras: a) 100 muestras de camarones cultivados Litopenaeus vannamei sintomáticos positivos para TSV; b) 100 muestras previamente analizadas mediante otras metodologías de PCR, también positivas para TSV; y c) 200 muestras procedentes de camarones certificados libre de patógenos específicos (controles negativos). Usando este protocolo se detectó el TSV en muestras de camarones infectados con baja carga viral, demostrando un nivel de sensibilidad más de 100 veces superior al nivel de los RT-PCR de ronda simple. La RT-PCR anidada mostró una sensibilidad y especificidad de 100%. La secuencia del fragmento de 294 pb de la primera amplificación fue 100% idéntica a la secuencia del TSV de la cepa venezolana. La secuencia del fragmento de 231 pb de la segunda amplificación también fue 100% idéntica a la secuencia del TSV venezolano. De acuerdo con los resultados, consideramos que la metodología propuesta resultaría útil para la implementación de medidas preventivas y de control para disminuir el impacto de esta enfermedad en la industria del cultivo de camarones. ABSTRACT: The development and sustainability of the shrimp culture in the Americas have presented viral epidemics that have greatly affected their production. In order to overcome these problems, the detection of infections using highly sensible diagnostic protocol has been proposed, such as the polymerase chain reaction (PCR). Here, we have designed a PCR protocol by nested, Reverse Transcription PCR (RT-PCR) for the detection of the Taura

syndrome virus (TSV). The evaluation of this protocol was carried out through the analysis of 400 samples: a) 100 tissue samples from cultivated Litopenaeus vannamei showing TSV symptoms; b) 100 samples of asymptomatic L. vannamei positive to TSV by other PCR protocols; and c) 200 shrimp samples, certified to be specific pathogen free ( negative controls). Using this protocol we have detected TSV in infected shrimp samples when was present at a very low level, showing more than 100 fold increase in the detection level compared to single round RT-PCR. The nested RT-PCR showed a sensitivity and specificity of 100%. The sequence of the 294 bp fragment of the first round of amplification was 100% homologous to the TSV sequence of the Venezuelan strain. The sequence of the 231 bp fragment of the second round of amplification was also 100% homologous to the Venezuelan TSV sequence. According to these results, the proposed protocol will be very useful for the implementation of preventive and control measures to decrease the impact of this disease to the shrimp industry.